ЛАЛ-тест - надежная замена контроля пирогенности на животных

Чайка Л.А., Гомон О.Н., Меркулова Ю.В.,
Государственный научный центр лекарственных средств, г. Харьков

Разработка альтернативных испытаниям на животных методов - этическая проблема, которая непосредственно связана с разработкой и валидацией фармакопейных биологических тестов, используемых при контроле качества лекарственных средств.

Согласно Государственной Фармакопеи СССР, XI изд., действующей пока в России и до недавнего времени - в Украине, парентеральные препараты и субстанции для их производства контролируются в испытаниях на животных по 8-ми общим статьям с несколькими разновидностями методик [1].

Для фармакологов ГНЦЛС, принимавших участие в работе над общими монографиями ГФУ по биологическим методам, а также разработавших более 400 методик биологических испытаний для частных статей, было очевидно, что замена тестов, проводимых на животных, альтернативными требует разумного анализа и четкой аргументации, подкрепленной данными статистики, т.к. затрагивает интересы, в первую очередь, пациентов, получающих парентеральные препараты, а также предприятий, производящих эти препараты, и контролирующих организаций, на которых лежит ответственность перед населением за безопасность выпускаемых препаратов.

Европейская Фармакопея, с которой гармонизирована Государственная Фармакопея Украины, в связи с общемировой практикой ограничения экспериментов на животных уже более 10 лет осуществляет комплексную программу, разработанную на основе принципов "три R": усовершенствование, сокращение и замена [2]. Эта концепция была предложена в 1959 году Russel W.M.S. иВш-chR.L. [З].

Усовершенствование любой методологии направлено на снижение или устранение болевых ощущений у животного.
Сокращение направлено на выбор метода, обеспечивающего использование минимального количества животных, однако позволяющего получить статистически значимый результат.Замена - стратегия, направленная на замену модели на животных иной, или использования в качестве модели животных таксономичес-ки более низко организованных (например, беспозвоночных) .

В Европейской Фармакопее 2002 года издания, исследования биологической активности гормонов, таких как гормон роста, окситоцин и др., заменены на методику их количественного определения хроматографически. Большое число частных монографий на вакцины уже не предусматривают биологические испытания на животных (исключение составляет контроль качества вакцин в тесте на пирогены на кроликах) [4].

Определение биологической активности инсулина, которое ранее проводилось одним из 3 фармакопейных методов с использованием от 40 до 96 мышей или не менее 18 кроликов, в настоящее время для целого ряда инсулинов заменено их количественным определением с помощью жидкостной хроматографии. Замена испытаний на животных альтернативным методом стала возможной благодаря появлению новой субстанции инсулина, получаемой не из поджелудочной железы животных (инсулин свиной, инсулин бычий), а как продукт биотехнологического производства. Такой инсулин содержит минимальное количество примесей, что и позволило проводить его количественную оценку химическим методом.
Следует, однако, отметить, что многочисленные попытки заменить фармакопейный метод испытания на аномальную токсичность на мышах альтернативным пока не увенчались успехом, т.к., к сожалению, все предложенные методы характеризуются низкой чувствительностью и воспроизводимостью. По-видимому, это связано с тем, что тест на аномальную токсичность позволяет выявить неизвестные или неожидаемые токсические примеси в субстанциях и инъекционных препаратах, контроль которых далеко не всегда возможно предусмотреть химическими методами.

Наиболее блестящим, примером замены испытаний на животных альтернативным методом является, конечно же, замена испытания на пирогены на кроликах определением содержания бактериальных эндотоксинов с помощью ЛАЛ-теста.

Появление в 1940 году фармакопейного метода - определение пирогенов в лекарственном средстве была обусловлена тем, что парентеральное введение пациенту препарата, загрязненного пирогенами, может привести к летальному исходу.

Пирогенность лекарственных средств имеет в подавляющем большинстве случаев микробное происхождение и вызывается граммотрица-тельными бактериями. Это высокотоксичные для человека липополисахаридные осколки клеточных стенок, которые образуются при разрушении бактериальной клетки. Эндотоксины очень устойчивы к обычным способам стерилизации и обладают широким спектром нежелательных для человека биологических эффектов, в том числе, лихорадка, тромбоцитопения, эндо-токсический шок, резкие метаболические нарушения, анафилактический шок.

Опасность пирогенных загрязнений всегда существовала в реальных условиях фармацевтического производства. Не снизилась она и сейчас.
Принцип метода, используемого многие годы для контроля уровня пирогенности лекарственных средств, основан на сравнительном анализе ректальной температуры тела как минимум у трех кроликов до и после введения препарата.

ЛАЛ-тест, как альтернатива тесту на кроликах, впервые появился в Фармакопее США, 20-е изд., в 1980 году и получил название "Определение бактериальных эндотоксинов". В 1984 году 5 описанных в USP препаратов воды содержали ЛАЛ-тест. В 23-м издании USP 680 препаратов содержат ссылку на раздел "Бактериальные эндотоксины". Даже в Китайской Фармакопее 2000 года издания для более чем 80 инъекционных препаратов мы находим указание на контроль предельного уровня эндотоксинов.

Появлению ЛАЛ-теста как фармакопейного метода предшествовала более чем дватцатилет-няя исследовательская работа.
46 лет назад, в 1956 году, американский ученый Bang F.B., работавший в лаборатории Института биологии моря, исследовал крабов мечехвостов.

Краб мечехвост - древнейшее морское животное, обитающее у восточных берегов Северной и Центральной Америки, Японии, Китая, Вьетнама и Индии. Мечехвостов еще называют "живущие ископаемые", т.к. современные крабы-мечехвосты мало чем отличаются от животных, чьи отпечатки обнаружены в отложенияхЮрского и Триасского периодов. Живут они на 20-метровой глубине.Bang F.B. обнаружил, что введение бактерий во внутрисосудистое русло мечехвостов вызывает свертывание крови и гибель животного [5]. Более того, как показали опыты Frederick Bang и доктора Jack Levin, сотрудника этой же лаборатории, аналогичная реакция наблюдалась при инъецировании мечехвосту не живых бактерий, а только обрывков клеточной стенке этих бактерий [6].

Каков же механизм этой реакции? У мечехвостов как очень древних и примитивных животных жидкость, переносящая кислород по организму, только отдаленно напоминает кровь человека и носит название "гемолимфа". Гемолимфа имеет голубую окраску и содержит только один тип клеток - амебоциты. Так как в морской воде, особенно в придонном ее слое - месте обитания мечехвостов, очень высока концентрация бактерий, природа подарила этим крабам примитивный, но очень надежный механизм защиты от вторжения патогенных бактерий. Любое повреждение покровов крабов-мечехвостов приводит к контакту клеток крови амебоцитов с бактериями, которые выступают в роли активаторов, "пускового механизма" реакции свертывания крови. Образовавшийся сгусток крови препятствует дальнейшей ее потере, закупоривая место повреждения, и предохраняет животное от заражения. Но несмотря на свою примитивность по сравнению с системами коагуляции млекопитающих и человека, этот защитный механизм исправно служит мечехвосту уже много миллионов лет.

Levin J. сразу же понял ценность открытой ими реакции амебоцитов с эндотоксинами и возможность ее практического применения: система свертывания была уникальной - высокочувствительной и одновременно совершенно простой - все компоненты системы свертывания локализованы только в одном типе клеток - амебоцитах. Это вселяло надежду, что создание реактивов для проведения теста будет элементарнейшей операцией.

Работа над созданием первого коммерческого реактива, содержащего клетки крови краба-мечехвоста, были начаты в 1970 году доктором Стенли Ватсоном, и очень маленькой на то время компанией - Associates of Cape Cod, которая первой получила лицензию FDA на производство этого реактива.

Реактив получил название LAL-реактив. Аббревиатура "LAL" - сокращение, образованное первыми буквами словосочетания "Limulus Amebocite Lisate": Limulus - название краба по-латыни, Amebocite Lisate - лизат клеток крови краба. Название реактива дало название тесту - LAL-тест.
В настоящее время компании по производству реактивов для проведения ЛАЛ-теста отлавливают в летний период крабов, берут около 30% крови (примерно 200 мл) и снова отпускают в море. Забор крови не приносит вреда животным, у которых объем крови восстанавливается в течение 3-7 дней, а количество амебоцитов
- за 4 месяца.

Таким образом, исследования Levin J. и Bang F.B. можно считать началом разработки метода количественного определения бактериальных эндотоксинов в самых различных средах. Особый интерес к этому открытию был обусловлен тем, что эндотоксины, как было уже сказано ранее, именно те вещества, которые в подавляющем большинстве случаев являются причиной пирогенности лекарственных препаратов. Наиболее важной и приоритетной областью применения этого метода стала фармацевтическая промышленность.

Замена теста на пирогены альтернативным ему - определением в препарате эндотоксинов
- тем более оправдано, так как доказана более низкая чувствительность кролика к пирогенам по сравнению с человеком. Так, у человека повышение температуры возникает при внутривенном введении 4-8 ЭЕУкг, по данным других авторов - 0,3 ЭЕ/кг, у кролика 10-15 ЭЕ/кг.
Представленная таблица наглядно демонстрирует насколько выше чувствительность ЛАЛ-теста в сравнении с тестом на пирогены на кроликах. Испытание 816 препаратов в тесте на пирогены на кроликах показали, что только у 2% животных наблюдалась пирогенная реакция на введение образцов, содержащих от 0,25 ЭЕ/мл до 1 ЭЕ/мл. При содержании эндотоксинов в препарате немногим более 1 ЭЕ/мл только у 11% кроликов регистрировалось значимое повышение температуры тела. В то же время ЛАЛ-тест, как показано в таблице, в каждом из более из 700 000 испытаний дал точный результат о содержании бактериальных эндотоксинов в образцах самых различных препаратов.

Еще одним явным преимуществом ЛАЛ-теста перед тестом на пирогены на кроликах является тот факт, что определенные группы инъекционных препаратов и технологического оборудования невозможно или некорректно испытывать на животных. К ним относятся:
o препараты-антипиретики, которые вызывают понижение температуры тела, что может маскировать наличие пирогенов (ненаркотические анальгетики, транквилизаторы, нейролептики, кортикостероиды, некоторые анестетики);

• препараты, которые вызывают повышение температуры тела, обусловленное фармакологическими свойствами, что мешает объективному анализу действительных причин гипертермии у животных (вакцины, препараты плаценты, новокаин);
• препараты, которые вызывают изменения физиологического состояния животных, обусловленные их специфическими фармакологическими свойствами (средства для наркоза, сердечные гликозиды, наркотические анальгетики, инсулин, адреналин, снотворные средства, деполяризующие миорелаксанты) ;
• инфузионные препараты, суточный объем введения, которых человеку составляет более 700 мл и выше;
  o радиофармацевтические препараты; oлекарственное сырье, ампулы, флаконы и
  все элементы технологического оборудования.

Экономически выгодно заменить также тест на кроликах определением эндотоксинов для таких препаратов, введение которых животному резко ограничивает возможность его дальнейшего использования (препараты антигенной природы, препараты крови). Например, причиной гибели кроликов при введении им большинства антибиотиков является действие большой дозы антибиотика на ферменты микрофлоры и, как следствие этого, дисбактериоз или, как при введении линкомицина гидрохлорида, кандидо-микоз.

Каковы источники попадания эндотоксинов в готовое лекарственное средство? Согласно регуляторным документам, опубликованным в FDA их несколько:

• в первую очередь, основным источником эндотоксинов всегда являлась вода, используемая как растворитель или для обработки;
• ампулы и флаконы;
• химические вещества и специально необработанные материалы, используемые в процессе производства лекарственного средства.

GMP предусматривает на производстве контроль уровня эндотоксинов во всех перечисленных выше потенциальных источниках пироген-ной загрязненности.
Фармацевтическая промышленность за рубежом для контроля технологического процесса широко использует ЛАЛ-тест. ЛАЛ-тест на сегодняшний день единственный способ максимально быстро провести постадийный контроль технологического процесса при производстве инъекционных препаратов.

В Государственной Фармакопее Украины в общей статье "Бактериальные эндотоксины" приведено 5 возможных методов проведения ЛАЛ-теста [7]:

1. Метод гелеобразования: предельное испытание
2. Полуколичественный метод гелеобразования
3. Турбидиметрический кинетический метод
4. Кинетический метод с использованием хромогенного пептида
5. Метод конечной точки с использованием хромогенного пептида

Отметим, что в настоящее время существует, по меньшей мере, тридцать два метода определения бактериальных эндотоксинов с помощью ЛАЛ-теста, используемых для научных исследования.
Согласно ГФУ основным базовым считается метод гелеобразования (предельный тест). Методика выполнения этого теста очень проста: образцы препарата, в некоторых случаях предварительно разведенного, и ЛАЛ-реактив помещают в специальные апирогенные пробирки и инкубируют при температуре 37°С в течение 60 мин в термостате или водяной бане без принудительного перемешивания, т.к. любые колебания могут привести к нарушению образования геля. Через 60 минут пробирки извлекают. Образование устойчивого геля регистрируют при однократном и осторожном переворачивании пробирок на 180°. Если при этом гель не сползает по стенкам пробирок, результат испытания считают положительным, а испытуемую серию препарата бракуют как содержащую большое количество эндотоксинов, способное вызвать пирогенную реакцию при введении пациентам. Метод гелеобразования, или, как его еще называют, гель-тромб тест) имеет целый ряд преимуществ перед остальными перечисленными ЛАЛ-методами:

• не требует дорогостоящего оборудования;
• не требует особых навыков выполнения; Хотя и гель-тромб тест не лишен недостатков,
  т.к. чувствительность этого метода значительно ниже, чем турбидиметрического и хромогенного метода определения содержания бактериальных эндотоксинов.

Повсеместному распространению ЛАЛ-теста за рубежом способствовала, конечно же, мировая тенденция к ограничению использования животных в эксперименте, а также ряд факторов финансово-экономического и маркетингового характера. Среди них важное значение имеет более высокая надежность и универсальность этого метода, что в условиях производства по правилам GMP является одним из рычагов повышения конкурентноспособности продукции.
Это обстоятельство немаловажно и для отечественных производителей парентеральных препаратов, поскольку ситуация на фармацевтическом рынке Украины, хоть и с отставанием, но/ все-таки следует мировым тенденциям.

За последние годы растет число фармацевтических предприятий Украины, сделавших шаг к переходу от испытаний на кроликах к ЛАЛ-тесту. К таким предприятиям относится ОАО "Фармацевтическая компания "Здоровье", ХГФП "Здоровье народу", "Индар", ЗАО НПЦ "Борща-говский химико-фармацевтический завод", ФФ "Дарница", АО "Галичфарм".
Нерешительность большинства отечественных заводов в отношении введения ЛАЛ-теста,
возможно, объясняется как экономическими причинами (необходимостью приобретать специальное оборудование и реактивы, провести обучение аналитиков), так и некоторыми сомнениями в качестве своей продукции. Однако, результаты наших исследований отечественных препаратов показывают, что в подавляющем большинстве случаев содержание бактериальных эндотоксинов в них не только не превышает, но и значительно ниже уровня, принятого в международной практике [8]. В качестве иллюстрации можно привести результаты, полученные при разработке раздела "Бактериальные эндотоксины" для антибиотиков, выпускаемых Борщаговским химико-фармацевтическим заводом. Содержание эндотоксинов в Цефуроксиме-БХФЗ и Цефазолине-БХФЗ в 50 и более раз ниже предельного уровня, установленного для этих препаратов в Европейской и Американской Фармакопеях.

Хотелось несколько слов сказать о перспективах развития теста на пирогены. Одна из причин разработки новых методов определения пи-рогенности продиктована тем, что использование крабов мечехвостов для производства ЛАЛ-реактива влияет на популяцию этих реликтовых животных. Одна из крупнейших фирм по производству ЛАЛ-реактива "Associates of Cape Cod Incorporated", признала, что смертность животных после взятия у них крови увеличивается на 3%, а исследования сотрудников FDA и ученых американских университетов говорят о повышении гибели мечехвостов на 10%. В настоящее время в Европейском Центре валидации альтернативных методов был зарегистрирован новый иммунохимическии метод контроля пирогенных загрязнений in vitro, разработанный немецким ученым Томасом Хартунгом. Метод, предложенный в 3-х модификациях, проводится с использованием цельной человеческой крови или клеток, выделенных из крови человека. Автор считает, что, предложенный им метод имеет целый ряд преимуществ по сравнению с тестом на кроликах и ЛАЛ-тестом: обладая чувствительностью последнего, позволяет контролировать пироген-ные загрязнения "неэндотоксиновой" природы.

В настоящее время, с полным на то основанием можно утверждать, что ЛАЛ-тест, пришедший на смену испытаниям на кроликах, не только позволяет во много раз увеличить надежность и воспроизводимость этого метода, но и является примером совершенно обоснованного ограничения использования животных в эксперименте при биологическом контроле безопасно-лекарственных средств.

Литература
1. Государственная фармакопея СССР: Вып. 1. Общие методы анализа / МЗ СССР. - 11-е изд., доп. - М: Медицина, 1987. - 336 с.
2. Council of Europe (1986) European Convention for the Protection of Vertebrate Animals Used for Experimental and Scientific Purposes / European Treaty Series, No. 123.
3. Russell, W.M.S. and Burch, R.L., The Principles of Humane Experimental Technique. Methuon, London, 1959.
4. European Pharmacopoeia, 4ni ed. - 2002.
5. Bang F.B. A bacterial disease of Limulus polyphemus // Bull. Johns Hopkins Hosp. - 1956. - V.98, No. 5. - P.325-337
6. Levin J., Bang F.B. The role of endotoxinin the extracellular coagulation of Limulus blood // Bull. Johns Hopkins Hosp. - 1964. - V.I 15. - P. 265-272.
7. Державна Фармакопея Украши / Державне тдириемство "Науково-експертний фармакопейний центр". - 1-е вид. - Хармв: Р1РЕГ, 2001. -556 с.
8. Меркулова Ю.В., Гомон О.Н., Чайка Л.А., Хованская Н.П. Определение содержания бактериальных эндотоксинов (ЛАЛ-тест) - фармакопейный метод. Сообщение 1 // Фар-маком, 2002. - № 3. - С. 37-42.