Альтернативные методы в фармакологии

Комарова И.В., Яременко Ф.Г., Божко Т.С., Ладогубец Е.В.
Институт проблем эндокринной патологии им.В.Я.Данилевского АМН Украины, г. Харьков

В последние десятилетия XX века актуальной проблемой научно-исследовательского сектора фармацевтической индустрии стала генерация принципиально новых подходов к вопросу создания оригинальных лекарственных субстанций. Это привело к активному использованию в процессах поиска и создания новых лекарственных средств разработок в области биотехнологии, генной инженерии, усовершенствованной методологии фармацевтического органического синтеза.

В фармацевтической индустрии существуют два основных направления разработок - усовершенствование существующих и создание новых лекарственных средств. На первом этапе эта задача реализуется путем синтеза значительного количества различных соединений и их первичного скрининга. Это очень трудоемкий процесс, поскольку в настоящее время соотношение между количеством соединений, синтезированных в лабораторных условиях с первичным изучением их фармакологических свойств и количеством соединений, которые становятся лекарственными средствами и поступают на фармацевтический рынок составляет 1:10 000. Для того, чтобы синтезированное соединение стало лекарственным средством, на его создание в мировой фармацевтической промышленности расходуется более 600 млн. долларов США и 10-12 лет кропотливой работы [1].

В последние годы в этой отрасли все шире внедряются современные технологии, радикально изменившие подходы к созданию лекарственных средств. К таким направлениям, прежде всего, относится комбинаторная химия, компьютерное моделирование молекул, тотальный высокоэффективный скрининг, компьютерное прогнозирование, виртуальный скрининг [1,2].

Комбинаторная химия использует специальные технологии для синтеза в микроколичествах большого ряда соединений из "структурных блоков". Комбинаторные библиотеки соединений, в которых может быть до нескольких тысяч индивидуальных веществ или, как правило, - смеси изомеров, размещенных в планшетах и готовых для дальнейшего тотального скрининга. Последний включает в себя пробы на ферментную активность, действие на клеточные рецепторы и осуществляется иммунофлюоресцентны-ми и радиоиммунологическими методами с использованием пикомольных концентраций тестируемых субстанций в тех же планшетах с лунками.

Виртуальный скрининг - это отбор соединений, существующих лишь в электронной форме, по определенным параметрам с использованием различных алгоритмов, которые чаще всего основываются на компьютерном анализе возможной качественной и количественной взаимосвязи между структурой соединения и его ожидаемой биологической активностью. Подобный отбор предполагает расчет и предсказание физических, физико-химических и фармакологических свойств ожидаемой субстанции.

Наряду с виртуальным скринингом используют компьютерное моделирование молекул - метод с обратным принципом, предполагающий установление структуры соединения-лидера с заранее заданной фармакологической активностью. Следует отметить, что большинство из перечисленных современных технологий являются чрезвычайно дорогостоящими и зачастую недоступными для молодой фармацевтической промышленности Украины. В связи с этим отечественные химики и фармакологи используют преимущественно традиционные методы синтеза и первичного скрининга предполагаемых биологически активных соединений, хотя появляются предпосылки для развития и внедрения современных технологий органического синтеза и скрининговых программ, как перспективного направления медицинской химии. В этой связи, в рамках стратегии виртуального скрининга, обращает на себя внимание перспективное направление поиска новых биологи чески активных соединений, основанное на анализе взаимосвязей структура - активность (Structure - Activity Relationships SAR; Quantitative Structure - Activity Relationships QSAR) для известных биологически активных веществ и на моделирование взаимодействий макромоделей-мишеней с низкомолекулярными лигандами. Хотя такого рода подходы, называемые "Компьютерным конструированием лекарств" (Computer Aided Drug Design, CADD), непосредственным образом связаны с компьютерными технологиями, они, по сути, относятся к мультидисциплинарным исследованиям, что требует привлечения знаний из различных областей естествознания [2].

В Москве, в НИИ Биомедицинской химии им. В.Н. Ореховича РАМН на основе методов SAR/QSAR проф. В.В. Поройковым с соавторами была разработана компьютерная программа прогноза спектра биологической активности PASS - Prediction of Activity Spectra for Substances, которая позволяет предсказывать свыше 780 фармакологических эффектов, биохимических механизмов действия, канцерогенность, мутагенность, терато-генность и эмбриотоксичность по структурной формуле соединения на основе анализа обучающей выборки известных соединений, принадлежащих к различным химическим классам [2]. В основу этой разработки легла идея о том, что избирательность того или иного биологического действия относительна и большинство соединений одновременно обладает многими видами биологической активности.

Возможность оценить общий спектр подобных эффектов, характерных для той или иной структуры, позволила бы отобрать на ранних стадиях исследования вещества, обладающие требуемой и не обладающие нежелательной направленностью воздействия. Точность такого прогноза составляет 85 %. С использованием программы PASS был получен прогноз биологической активности более, чем 100 соединений, синтезированных в ИПЭП, в лаборатории синтеза гормоноподобных соединений. В ряде случаев помимо подтверждения прогнозируемой биологической активности, программа выявила значительно более широкий спектр фармакологических и биологических эффектов, что позволяло отчасти раскрыть механизмы их действия. Касаясь вопросов традиционных стандартных скрининговых исследований специфической активности в условиях in vivo, в области разработки соединений, обладающих потенциальной антитиреоидной и тиреостатической активностью, необходимо обратить внимание на возможные ошибки при их оценке. Подобные погрешности могут быть связаны с тем, что нормальный баланс в системе гипофиз - щитовидная железа и результаты гормональных исследований могут модифицироваться под влиянием ч исследуемых веществ таким образом, что стандартная оценка специфической активности по параметрам изменения плазменного уровня Т3и Т4 у подопытных животных либо не отразит реальных изменений тиреоидной функции, либо

даст о них неполное, а зачастую - и искаженное представление. Это положение в данном контексте представляется возможным проиллюстрировать данными, касающимися неспецифического, побочного действия на гипофизарно-тиреоидную систему многих известных лекарственных веществ. Основные механизмы, согласно которым лекарственные препараты могут нарушать функционирование этой системы и изменять результаты гормональных исследований приведены в Табл. 1 и 2 [3]. Эти эффекты могут быть комплексными, поскольку ряд препаратов, например, амиодарон, глюкокортикоиды и фенитоин могут воздействовать сразу на несколько компонентов системы (Табл. 2).

Таблица 2

Препарат	Механизм действия
Глюкокортикоиды	Подавление секреции ТТГ, нарушение высвобождения гормонов из щитовидной железы, подавление 5'-дейодирования, снижение уровня тироксинсвязывающего глобулина
Амиодарон	Поступление избытка йода, йодиндуцированный тиреотоксикоз, идуцированный гипотиреоз, тиреотоксикоз в результате развития специфического тиреоидита, антагонизм с рецепторами тиреоидных гормонов, стимуляция секреции ТТГ
Фенитоин	Подавление связывания Т4 и Т3 с ТСГ, ускорение клиренса и метаболизма Т4, воздействие на рецепторы тиреоидных гормонов

Изложенные выше факты свидетельствуют о том, что лекарственные средства и биологически активные соединения могут спровоцировать развитие серьезных нарушений в системе гипофиз - щитовидная железа и обусловить получение неадекватных результатов при исследовании тиреоидной функции. Детальное знание подобных эффектов различных групп такого рода соединений может способствовать расширению методологических подходов к адекватной оценке активности гипофизарно-тиреоидной системы, позволяющих всесторонне, с минимальной погрешностью, оценить ее функциональное состояние при первичном скрининге предполагаемых тиреостатиков в условиях in vivo.

Для сведения к минимуму возможных ошибок в оценке влияния тестируемых соединений непосредственно на тиреоидную паренхиму, когда позволяют условия проведения их апробации, потенциальные тиреостатики рекомендуется тестировать на наличие специфической активности в условиях in vitro - на клеточной культуре или срезах ткани щитовидной железы. Подобный методический подход в настоящее время получил широкое распространение в различных областях исследований, от клеточной и молекулярной биологии, до быстро прогрессирующих прикладных областей биотехнологии.

Следует однако обратить внимание на особенности работы и проблемы, связанные с выбором объекта биологического тестирования специфической активности соединений, влияющих на функциональную активность щитовидной железы. Клеточная культура представляет монослой пролифелирующих клеток, происходящих либо от недифференцированных клеток - предшественников, либо, что случается реже, - от полностью дифференцированных клеток, у которых способность к пролиферации достаточно быстро практически утрачивается [ 4 ]. Известно, что динамические свойства культивируемых клеток часто трудно контролировать, и некоторые клеточные взаимодействия, наблюдаемые in vivo, бывает трудно реконструировать in vitro.

В связи с этим многие исследователи отказываются от идеи серийного размножения клеток in vitro, предпочитая использовать системы, сохраняющие структурную целостность исходной ткани. Тканевыми культурами изначально называли эксплантаты целых фрагментов тканей, сохраняющих гистологическую целостность. Теперь это понятие расширилось и включает в себя как органную культуру, в которой небольшие фрагменты эксплантируются с сохранением тканевой архитектуры, так и культуру клеток, когда ткани диспергируются тем или иным способом [ 4, 5 ]. При выборе типа культуры следует принимать во внимание следующие соображения. Органная культура сохраняет межклеточные взаимодействия, в течение долгого периода поддерживает гистологическую и биохимическую дифференцировку и после начальной травмы эксплантации и ряда центральных некрозов остается, как правило, в нерастущем равновесном состоянии в течение нескольких дней. Однако эти культуры не способны к размножению, в экспериментах наблюдаются значительные разбросы в параллелях, количественные исследования органных культур осложняются из-за небольших различий в размерах и составе эксплантатов. Культуры клеток, напротив, лишены, как правило, структурной организации, теряют характерные гистотипические характеристики и связанные с ними биохимические признаки и обычно не достигают равновесного состояния при отсутствии специальных условий. Наряду с этим клетки в культурах стабильно размножаются, что обеспечивает их разделение на идентичные параллели и сводит разброс анализируемых показателей к минимуму. В связи со сложностями условий поддержания жизнеспособности клеточной культуры, отсутствием необходимости фактора ее стабильного роста, для проведения первичного скрининга и детального изучения специфической активности на непродолжительном отрезке времени (до одних суток), оптимальной является работа с органной культурой, в нашем случае - со срезами щитовидной железы животных или человека, полученными субоперационно. Преимущества работы с тканями железы человека обусловлены, в первую очередь, тем, что на экспериментальных моделях гипертиреоза в настоящее время невозможно адекватное воспроизведение патологического состояния щитовидной железы, характерного для заболевания диффузным токсическим зобом, а также возможным наличием видовой чувствительности к действиям тестируемых эффекторов [6]. Преимущество же работы со срезами щитовидной железы экспериментальных животных заключается в доступности большого количества биологического материала.

В то же время, работа с тканью железы in vitro позволяет сократить количество лабораторных животных в 2-4 раза по сравнению со скрининговыми исследованиями, проводимыми in vivo. Критериями эффективности тиреостатиков при их апробации на щитовидной железе в условиях in vitro являются показатели уровня секреции свободного тироксина и трийодтиронина в инкубате, величина содержания тиреоидных гормонов в самой железе, аккумуляция циклических нуклеотидов, в первую очередь цАМФ в фрагментах железы после ее экспозиции с исследуемыми эффекторами и захват 14С-тимидина срезами железы - как показатель, характеризующий ее белковосинтетическую функцию [6]. Программа и объем исследований обусловлены возможностями лаборатории и поставленными задачами. Подводя итог всему вышесказанному, можно сделать общее заключение о том, что современные подходы в области поиска и создания новых лекарственных средств позволяют проводить тотальный скрининг на минимальных количествах синтезированных соединений с максимальной эффективностью и скоростью без уничтожения большого количества лабораторных животных, неизбежного при традиционном лркрининговом мониторинге.

ЛИТЕРАТУРА

1. Р.Б.Лесник, Б.П.Громовик, Д.В.Атаманюк, 1.Ю.Субтель-на, П.Соронович. Сучасш шдходи до моделювання лжарсь-ких засоб1в // Фармацевтичний журнал. - 2002. - № 2. -С.33-39

2. V.V.Poroikov, D.A.Filimonov & assotiates PASS: Prediction of Activity Spectra for Substanses. - Инструкция для членов ассоциации пользователей PASS по пополнению обучающей выборки. - М, 2002.- 40 с.

3. J.R.Stockigt. Drug influences on the thyroid function // Thyroid international. - 2000. - N 2. - 17 p.

4. Культура животных клеток. Методы. / Под ред. Р. Фреш-ни. - М.: Мир. - 1989. - 315 с.

5. Kraiem Z., Sadeh О., Sobe) E. Triiodthyroninaand 3',5'-cyclic AMP secretion by cultured human thyroid cells in response to thyrotropin and thyroid-stimulating immunoglobulin. //Acta endocrinol. - 1988.-119.- № 4.-P. 493 - 500

6. Ром-Бугославська О. С, Божко Т. С, Комарова I.B., Ла-догубець О. В., Пивоваревич Л. П., Яременко Ф.Г., Лсгонь-кова I. Ю. Доюишчне вивчення тиростатичних та тиро1дсти-мулюючих засоб1в // Дрюитчш досл1дження лжарських 3aco6iB: Метод, рекомендаци. - К., 2001. - С. 409-420.