Изучение иммуномодулирующего влияния лекарственных препаратов в опытах in vitro

Гладкова Л.В.
Государственный научный центр лекарственных средств, г. Харьков

Иммуномодулирующими средствами являются препараты химической или биологической природы, способные модулировать (угнетать или стимулировать) реакции иммунитета в результате воздействия на иммунокомпетентные клетки, на процессы их миграции или на взаимодействие таких клеток или их продуктов (лим-фокины, монокины, антитела и др.) с соответствующими мишенями. В качестве мишеней могут выступать антигены, антитела, клетки опухолей, трансплантата или собственного организма, включая иммунокомпетентные клетки.

Система иммунитета представлена лимфоид-ными органами и тканями - центральными (тимус, костный мозг, пейеровы бляшки) и периферическими (селезенка, лимфатические узлы, кровь), расположенными в различных участках организма и функционирующими как единое целое в результате постоянного интенсивного обмена лимфоцитами - главными клетками иммунной системы.

Предшественниками всех клеток систем иммунитета являются самоподдерживающиеся по-липотентные стволовые кроветворные клетки костного мозга. Именно они являются прародителями антиген реактивных клеток (лимфоциты, макрофаги), воспринимающих антигенное раздражение и реагирующих на него иммунными реакциями.

Реакции иммунитета делятся на две основные группы - реакции клеточного типа и реакции гуморального типа.

Реакции клеточного типа развивают тимусза-висимые или Т-лимфоциты. Они формируют Т-систему иммунитета. Т-лимфоциты происходят из тимуса, заселяют Т-зависимые области периферических органов и под влиянием антигенной стимуляции накапливаются в них в виде сенсибилизированных клеток. Т-лимфоциты являются эффекторами Т-системы иммунитета - обеспечивают развитие реакции гиперчувствительности замедленного типа, отторжение пересаженных тканей и другие реакции трансплантационного иммунитета, например, реакцию "трансплантат против хозяина", противовопухо-левый иммунитет, защиту организма против ряда бактерий и вирусов.

Реакции гуморального типа развивают В-лимфоциты. Они формируют В-систему иммунитета. Заселяют В-зависимые области периферических лимфоидных органов и под влиянием антигенного стимула накапливаются в них в виде плазматических клеток - продуцентов антител, дифференцирующихся из В-лимфоцитов. В-лимфоциты являются эффекторами В-системы иммунитета, они вырабатывают специфические антитела. Специфически связываясь с антигенами, антитела нейтрализуют их и способствуют выведению антигенов из организма.

Помимо эффекторных, каждая из указанных популяций содержит субпопуляции регулятор-ных клеток, усиливающих или угнетающих клеточный или гуморальные реакции иммунитета. Как в случае Т-системы, так и в случае В-системы, функционирование периферических лимфоидных органов зависит от центральных. Клетки системы мононуклеарных фагоцитов через серию предшественников созревают в макрофаги. Они захватывают (фагоцитируют) антиген, перерабатывают его и в виде иммуно-генных молекул представляют Т- и В-лимфоци-ты. Макрофаги обладают также способностью оказывать цитотоксическое действие на клетки-мишени, усиливать и угнетать иммунные реакции.

Под влиянием антигенной стимуляции лим-фоидные клетки совместно с макрофагами развивают весь спектр иммунологических реакций, "сила" которых характеризует конкретную иммунологическую реактивность данного организма на данный конкретный антиген. Важная роль в развитии реакций иммунитета и их регуляции принадлежит взаимодействиям иммунокомпе-тентных клеток, опосредуемым через продуцируемые ими медиаторы - лимфокины (вырабатываются лимфоцитами) и монокины (вырабатываются макрофогами). Совокупность функций, выполняемых иммунокомпетентными клетками, является функцией иммунитета в целом. Обнаружение высокой гетерогенности клеток лимфоидной системы, открытие функционально альтернативных субпопуляций лимфоцитов, выделение и установление возможности моделирования отдельных этапов иммуногенеза, обеспечивающих накопление в лимфоидной ткани клонов эффекторных и регуляторных клеток, поставило задачу направленной регуляции отдельных звеньев развивающегося иммунного процесса. Решение этой задачи немыслимо без поиска и создания новых иммуномодулирую-щих средств направленного действия.

В связи с широким использованием в современной клинической практике иммунотропных препаратов животного, растительного и бактериального происхождения все более актуальной становится проблема раннего выявления их токсичности и прогнозирования специфических эффектов. Особое значение эта проблема приобретает в связи с возрастающим количеством новых синтетических соединений - потенциальных субстанций для создания готовых лекарственных форм (ГЛФ) разной направленности действия - поскольку оценка их влияния на иммунную систему является одним из основных показателей при вынесении решения о возможности медицинского применения. В связи с вышеизложенным представляется целесообразным дальнейшее совершенствование имеющихся и разработка новых методов иммунофарма-кологических исследований, позволяющих в короткие сроки достоверно оценивать влияние субстанций и ГЛФ на иммунную систему. Кроме того, это позволит приблизить уровень исследований к международным требованиям.

Этим основным требованиям отвечают исследования in vitro на клетках и клеточных культурах, которые все чаще используют в иммуно-фармакологической практике в качестве экспе-риментальнвгх моделей.

По сравнению с исследованиями in vivo использование в качестве объектов культур клеток имеет ряд преимуществ, основными из которых являются:

- высокая стандартность объектов эксперимента, поскольку культуры представляют собой генетически однородную популяцию клеток, растущих в постоянных условиях;
- высокая чувствительность клеточных культур к изменениям условий существования при воздействии химических и др. факторов;
- возможность оценки жизнеспособности клеток на протяжении всего эксперимента;
- возможность использования относительно малого количества биологического материала вместо дорогостоящих линейных животных, что позволяет одновременно проводить испытание нескольких препаратов в различных дозах, а также различных схем их применения.

Следует особо подчеркнуть, что использование клеточных культур человека при доклинических исследованиях создает уникальную возможность уменьшения вероятных ошибок и отрицательных результатов при клинических испытаниях, поскольку некоторые иммунобиологические параметры у лабораторных животных и человека отличаются как в физиологическом, так и в патогенетическом аспектах.

Все это свидетельствует о перспективности метода культивирования иммунокомпетентных клеток при иммунофармакологическом скрининге и углубленном изучении различных фармакологически активных веществ и ГЛФ in vitro. При этом важной задачей является разработка тест-систем, в которых в качестве базовых экспериментальных моделей используются различные иммунокомпетентные клетки - В- и Т-лим-фоциты, их субпопуляции, макрофаги и др., являющиеся основным морфологическим субстратом системы иммунной защиты у млекопитающих.

Исследования функциональной активности иммунокомпетентных клеток in vitro позволяют детализировать механизмы иммунотропного действия, что весьма затруднительно в опытах in vivo.

Цель настоящего сообщения заключается в описании комплекса стандартных методик, с помощью которых можно оценить эффект изучаемого вещества на иммунитет in vitro. В настоящее время в лаборатории иммунофармакологии и аллергологии ГНЦЛС используются следующие методики:

- оценка влияния фармакологического препарата на неспецифическую резистентность;
- оценка влияния препарата на пролифера-тивную активность Т- и В-лимфоцитов;
- оценка влияния препарата на синтез цито-кинов;
- оценка влияния препарата на функциональную активность естественных киллеров;
- определение субпопуляций регуляторных Т-лимфоцитов (Т-хелперов и Т-супрессоров);
- оценка функциональных свойств иммуно-регуляторных клеток в тестах конканвалин А индуцированной супрессорной активности;
- оценка пролиферативной активности Т- и В-лимфоцитов в реакции бласттрансформации на митоген;
- оценка митогенных свойств препарата. Для того, чтобы отнести тот или иной препарат к разряду иммунотропных средств, целесообразно изучить его влияние на гуморальный и клеточный иммунитет и способность усиливать неспецифическую резистентность организма.

Действие иммуномодулирующих препаратов in vitro на гуморальное и клеточное звено иммунитета оценивается в реакции розеткообразова-ния, основанной на различиях рецепторной структуры Т- и В-лимфоцитов. Т-клетки имеют на свой мембране рецепторы к чужеродным эритроцитам, в частности, к эритроцитам барана, благодаря чему происходит спонтанное присоединение к поверхности Т-лимфоцитов. Это проявляется образованием фигур, напоминающих розетки. Определение таких розеткообразующих клеток дает представление о количестве Т-лимфоцитов. Для более точной характеристики иммунной системы необходимо иметь данные не только о функциональной активности популяций лимфоцитов Т и В, но и их субпопуляций. Поэтому в иммунофармакологии используются тесты для количественного определения субпопуляций Т-лимфоцитов, обладающих хелперными и супрессорными свойствами.

Обработка эритроцитов барана антителами и комплементом позволяет выявить розеткообразование В-клетками. Помимо этого теста количество В-лимфоцитов определяется с использованием эритроцитов беспородных белых мышей.

Следующей реакцией оценки влияния иммуномодулирующих препаратов на клеточный иммунитет in vitro является реакция бласттранс-формации лимфоцитов (РБТЛ), которая заключается в способности малых лимфоцитов периферической крови через 72-96 часов после первичного контакта с митогенами (фитогеммаг-глютинин, конканавалин А, антилимфоцитарная сыворотка, митоген лаконоса) или после вторичного контакта с микробными тканевыми антигенами превращаться в крупные не дифференцированные клетки-бласты. РБТЛ с митогенами является показателем функциональной активности Т- и В-системы иммунитета.

С использованием РБТЛ определяется активность Т-супрессоров по выделению ими в сыворотку крови фактора, угнетающего бласттрансформацию лимфоцитов. Активность данного фактора можно определить стимуляцией Т-супрессоров конканавалином А и затем добавлением этих клеток в тест-культуру лимфоцитов с ФГА. По степени торможения интенсивности пролиферативного ответа судят о Т-супрессор-ной активности.

РБТЛ используют также для оценки митогенных свойств самого препарата. В данном случае в роли митогена выступает исследуемый препарат.

Важную роль в формировании, как специфических реакций иммунитета гуморального и клеточного типа, так и неспецифической резистентности организма играет функциональная активность макрофагов - их способность к миграции, захвату, переработке и уничтожению антигенного материала. Действие иммуномодуляторов на клетки системы мононуклеарных фагоцитов оценивается in vitro в реакции спонтанной миграции макрофагов и по их фагоцитарной активности (фагоцитарный индекс и переваривающая способность).

С этой же целью используется также метод фагоцитарной активности нейтрофилов.

In vitro оценивается также влияние препарата на функциональную активность естественных киллеров. Естественные киллеры представляют собой большие гранулярные лимфоциты, Они играют важную роль в защите организма от различных внутриклеточных микроорганизмов и опухолевых клеток. Естественные киллеры распознают и убивают клетки-мишени без предварительной их сенсибилизации. Функциональную активность естественных киллеров определяют в цитотоксической реакции по их способности лизировать клетки-мишени (клетки миелолейкоза человека).

In vitro изучается специфическое иммунотропное действие препаратов на синтез цитокинов. В качестве материала в данном тесте используют супернатанты культур мононуклеаров, полученные от клеток, стимулированных Т-митогеном в реакции бласттрансформации лимфоцитов. При наличии в лаборатории соответствующих технических возможностей этим методом возможно исследовать такие цитокины как ин-терлейкин-1, -2, -4, -5, -6, -8,-10, -12, а также цитокины, определяющие функциональную активность центральных регуляторных клеток.

Таким образом, использование клеточных культур при иммунофармакологических исследованиях является целесообразным и обоснованным и дает возможность изучить действие препарата на все три клеточные системы, которые обеспечивают реализацию иммунных реакций, а также позволяет сопоставление митогенного, митостатического и лимфостатического действия препарата.

Лабораторные животные - возможные альтернативы в экспериментальной фармакологии.
Материалы международного семинара. Харьков, 2002